羊肚菌是测多测定四大名贵食用菌之一，因其菌盖表面有许多不规则凹陷且多有褶皱，评法状似羊肚而得名，羊肚主要分布在云南、菌中基酸贵州、种氨青海、测多测定西藏等地。评法羊肚菌肉质鲜美，羊肚风味独特，菌中基酸营养丰富，种氨富含蛋白质、测多测定矿物质、评法多糖等物质，羊肚有提高免疫力、菌中基酸抗癌等药用价值。种氨氨基酸作为蛋白质的基本组成单元和人体的所需营养成分，具有多种不同的生理功能，能判断食品的营养价值，同样也关联和影响食品的风味，是食品质量评价的重要指标，所以羊肚菌中氨基酸的含量是衡量羊肚菌品质优劣的重要指标。
在国家标准GB/T5009.124-2016中，测定氨基酸采用外标法，吴素蕊、张航、黄世群等对羊肚菌氨基酸的研究多数均采用外标法，但该方法不能消除实验中的误差以及标准品与待测样品之间的基体差异所导致的基质效应，对实验结果的准确度有一定影响；内标法由于内标物质和待测组分来自同一基体，当实验条件发生非人为变化时，两者会受到相同影响，消除了系统误差，使分析更加准确。为了更好地评价羊肚菌的品质，需对羊肚菌中氨基酸的含量进行全面、准确的控制，但检测物质较多，成本过高且耗时过长。QAMS法通过测定一个成分而实现多个成分的同步测定，大幅度降低成本和实验人员的工作量，比传统质量控制方法更加经济、高效、简单。
本研究采用一测多评法测定羊肚菌中17种氨基酸的含量，并对云南、新疆、贵州等6个不同地区的羊肚菌测定研究，本文为衡量羊肚菌的食用价值和品质优劣提供了科学依据，为羊肚菌的开发利用指明了方向。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
羊肚菌采集于新疆伊犁州、云南丽江市、贵州剑河县、贵州铜仁市万山区、贵州贵阳市长坡岭森林公园、贵州贵阳市乌当区长坡六个地区，羊肚菌置于干燥箱70℃烘干后，粉碎处理，过60目筛，粉末密封待用；甲醇、乙腈、三乙胺、正己烷 均为色谱纯，天津科密欧化学试剂有限公司；异硫氰酸酯（PITC）纯度大于98%，上海麦克林生化科技有限公司；乙酸铵、冰醋酸 均为分析纯，天津科密欧化学试剂有限公司；超纯水 自制；18种氨基酸[天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、精氨酸（Arg）、苏氨酸（Thr）、缬氨酸（Val）、异亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Trp）、甘氨酸（Gly）、组氨酸（His）、丙氨酸（Ala）、甲硫氨酸（Met）、赖氨酸（Lys）、脯氨酸（Pro）、丝氨酸（Ser）、茶氨酸（The）] 纯度均大于98%，北京世纪奥科生物技术有限公司。
Agilent1100高效液相色谱仪（方法学考察所用）、Agilent1260高效液相色谱仪，安捷伦科技有限公司；DZKW-电热恒温水浴锅，天津天泰仪器有限公司；200T粉碎机，永康铂欧五金制品有限公司；AL-104电子天平，梅特勒-托利多公司；CH-250超声波清洗机，北京创新德超声电子研究所；DiscoveryDV215CD分析天平，上海奥豪斯仪器有限公司；202-1型恒温干燥箱 上海实验仪器厂有限公司。
1.2 实验方法
1.2.1 溶液的配制
1.2.1.1 内标溶液
精密称取茶氨酸，配制浓度为0.404mg/mL的内标溶液。
1.2.1.2 标准品溶液
精确称取Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys等17种氨基酸至10mL容量瓶中，加水定容得到混标储备液。移取1mL混标储备液和0.5mL内标溶液于5mL容量瓶，加水定容，得到0.0397、0.0496、0.0218、0.0208、0.0078、0.1017、0.0311、0.0447、0.0277、0.0182、0.0207、0.0061、0.0184、0.0263、0.0170、0.0181、0.0446mg/mL的混合氨基酸标准溶液。
1.2.1.3 衍生化试剂
衍生试剂A：取1.4mL1mol/L的三乙胺溶液至10mL容量瓶，用乙腈定容，摇匀；衍生试剂B：吸取125μLPITC至10mL容量瓶，用乙腈定容至刻度，摇匀。
1.2.2 样品溶液制备与衍生化
1.2.2.1 样品溶液与空白溶液制备
准确称取20mg羊肚菌于安瓿瓶中，加6.0mol/L的HCl溶液2mL，吹入氮气后密封，将其置于（105±5）℃恒温干燥箱中24h，使氨基酸完全水解。取出冷却后置80℃水浴挥干，多次加水挥发盐酸。加1mL蒸馏水溶解，超声后得到样品溶液。将0.5mL的内标溶液和样品溶液移加至5mL容量瓶，加水定容，得到样品供试溶液，等待衍生。吸取0.5mL的内标溶液加至5mL容量瓶，加水定容，得空白溶液。
1.2.2.2 氨基酸的衍生化
精密吸取200μL的氨基酸标准溶液（或样品供试溶液、空白液）于离心管中，加入衍生试剂A、B各100μL，置40℃水浴锅中反应1h，加入400μL正己烷，振荡静置10min。取澄清的下层液，过0.45μm滤膜，即得待测样品。
1.2.3 色谱条件
分离柱为依利特HypersilODS2（5μm，250mm×4.6mm）；流动相A：0.05mol/L乙酸铵溶液（pH6.5）；流动相B：乙腈；梯度洗脱（0min，0.8%B；14min，5%B；16min，6%B；16.1min，4%B；21min，4%B；21.1min，3.5%B；30min，3.5%B；32min，8%B；40min，15%B；40.1min，16.5%B；44min，16.5%B；44.1min，20.8%B；50min，23%B；60min，25%B）；流速为1mL/min；检测波长为254nm；柱温为35℃；进样量为5μL；
1.2.4一测多评方法学考察
1.2.4.1 线性考察
精确吸取0.25、0.5、1、2、4mL的混标储备液，分别置于5mL容量瓶，再分别加入0.5mL内标溶液，加水定容，摇匀，进行衍生化处理，按上述的色谱进样测定。以氨基酸对照品的浓度（mg/mL）为X轴，峰面积为Y轴进行线性回归
1.2.4.2 相对校正因子的计算
平行取混合标准溶液6份，进行衍生化处理，按上述的色谱条件测定。以Glu为内参物，根据相对校正因子（RCF，fkm）公式fkm=（Ck×Am）/（Cm×Ak），计算相对校正因子，式中Ck、Cm为内参物和待测成分的浓度，Am、Ak为内参物和待测成分的峰面积。
1.2.4.3 精密度试验
精密吸取混合标准品溶液，进行衍生化处理后按上述的色谱条件连续测定6次，记录17种氨基酸（Asp、Glu、Ser、Gly、His、Thr、Ala、Arg、Pro、Tyr、Val、Met、Ile、Leu、Phe、Trp、Lys）的峰面积，计算RSD值以评价仪器的精密度。
相关链接：缬氨酸，异亮氨酸，甲硫氨酸，冰醋酸
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